Gli utilizzi del meccanismo CRISPR/Cas
L’editing del genoma è un intervento di precisione che consente la correzione mirata di una sequenza di DNA. La correzione mirata avviene grazie alle proteine sopra citate, sono una sorta di forbici molecolari e sono capaci di tagliare il DNA nel punto desiderato. Nelle giuste condizioni sperimentali questo processo può essere usato per introdurre i cambiamenti desiderati, con una precisione che non ha precedenti nella storia dell’ingegneria genetica. La tecnologia CRISPR può produrre mutazioni puntiformi, indistinguibili da quelle naturali, che possono essere impiegate per spegnere un gene dannoso (knock out genico). Se necessario è possibile anche inserire un segmento nuovo di DNA. Questi "trucchi" si stanno rivelando preziosi per la ricerca di base, perché consentono di indagare, ad esempio, le basi molecolari delle malattie genetiche. Poiché il sistema funziona in tutti gli organismi – dai batteri, alle piante, all’uomo – le possibili applicazioni appaiono quasi illimitate. Tra le aree di ricerca più promettenti in biomedicina ci sono lo sviluppo di nuovi farmaci, le terapie geniche e cellulari, gli xenotrapianti, il controllo delle malattie trasmesse dagli insetti. Gli scienziati, per ora, scoraggiano il cosiddetto editing della linea germinale, ovvero la correzione dei geni difettosi negli embrioni umani, perché l’intervento sarebbe ereditato dalle generazioni successive. Molte le possibili applicazioni in campo agroalimentare, ad esempio per rendere le piante più resistenti agli stress senza modificarne gusto e qualità nutrizionali. In campo industriale, infine, si spera che l’editing genomico favorisca lo sviluppo di prodotti utili come una nuova classe di biocombustibili. Le diverse applicazioni comportano vantaggi, rischi e considerazioni etiche differenti, perciò andrebbero valutate separatamente. Gli utilizzi di CRISPR sono innumerevoli, qui ne possiamo vedere alcuni:
Grano senza glutine
Il grano contiene decine di geni che producono proteine tossiche per i celiaci (gliadine). La tecnica di editing genomico CRISPR potrebbe consentire di eliminarli tutti e in Spagna sono già vicini al traguardo. I ricercatori dell’Istituto per l’agricoltura sostenibile di Cordova sono riusciti a inattivare fino a 35 di questi geni, riducendo l’immunoreattività (e dunque la tossicità) dell’85 per cento. L’obiettivo del cento per cento ora sembra a portata di mano. Molte delle linee che hanno descritto nell’ultimo studio hanno un contenuto ridotto di gliadine e non presentano geni estranei né inserzioni. Se ne stanno generando altre, sempre libere da transgeni e con ulteriori proteine del glutine modificate, quindi non si tratterebbe di grano transegenico. CRISPR è versatile e offre alcuni vantaggi anche sul piano tecnico, consentendo di inattivare i geni indesiderati in modo stabile ed ereditabile, ottenendo caratteristiche che sono indipendenti dalle condizioni ambientali. Inoltre potrebbe essere usata anche in modo diverso da come è stato fatto finora, per eliminare frammenti cromosomici più grandi che contengono più geni delle gliadine, o addirittura per sostituire i frammenti altamente immunogenici con altri meno tossici, mantenendo la funzionalità delle gliadine. Aver inattivato un numero tanto elevato di geni è già un risultato senza precedenti.
Suini senza i retrovirus endogeni
Un gruppo di ricercatori della società biotecnologica eGenesis di Cambridge, Massachusetts e della Yunnan Agricultural University a Kunming, in Cina, è riuscito a produrre dei maiali che non sono portatori di retrovirus suini. L'eliminazione dei geni retrovirali è stata ottenuta usando la tecnica di correzione genetica CRISPR-Cas9. La ricerca - illustrata su "Science" - rappresenta un passo significativo verso l'uso di xenotrapianti per la terapia di malattie umane. La possibilità di ricorrere a un trapianto oggi è limitata dalla cronica carenza di organi e tessuti umani. Una prospettiva promettente è quella di utilizzare organi animali, in particolare dei suini, considerati particolarmente adatti. Tuttavia nel genoma del maiale sono presenti retrovirus endogeni suini (PERV), che in caso di trapianto potrebbero essere trasmessi all'uomo con effetti potenzialmente pericolosi. Precedenti ricerche per eliminare i PERV con tecniche di editing genetico avevano dato risultati abbastanza incoraggianti nelle linee cellulari coltivate in vitro ma non negli animali vivi. George Church, Dong Niu e colleghi hanno prelevato dei fibroblasti (cellule del tessuto connettivo) di maiale, mettendone alcuni in coltura con cellule umane, in modo da rilevare il passaggio di PERV dalle cellule di suino a quelle della nostra specie. Hanno quindi mappato e caratterizzato i PERV presenti nei fibroblasti di maiale, identificandone 25 in totale, e sono poi intervenuti con CRISPR-Cas9 su quelle cellule per disattivare tutti e 25 i siti genomici. La popolazione cellulare così ottenuta conteneva però un numero molto elevato di cellule con modificazioni indesiderate che ne impedivano una coltura efficiente. La ripetizione della procedura con l'aggiunta in coltura di fattori che facilitano riparazione del DNA dopo l'intervento di CRISPR-Cas9 ha permesso di ottenere cellule vitali con il 100 per cento dei PERV disattivati. I ricercatori hanno quindi creato degli embrioni di maiale con la tecnica del trasferimento nucleare, per poi impiantarli in scrofe surrogate.
Correzione dei geni che causano la cardiomiopatia ipertrofica
Una prima dimostrazione della possibilità di correggere in modo sicuro mutazioni genetiche patogene in embrioni umani - in modo da impedirne la trasmissione alle generazioni future - è stata realizzata da un gruppo di ricercatori della Oregon Health & Science University e del Salk Institute for Biological Studies a La Jolla, in collaborazione con altri centri universitari internazionali, che illustrano il loro studio su "Nature". Una prima dimostrazione della possibilità di correggere in modo sicuro mutazioni genetiche patogene in embrioni umani - in modo da impedirne la trasmissione alle generazioni future - è stata realizzata da un gruppo di ricercatori della Oregon Health and Science University e del Salk Institute for Biological Studies a La Jolla, in collaborazione con altri centri universitari internazionali, che illustrano il loro studio su "Nature". Shoukhrat Mitalipov e colleghi hanno dimostrato che con la tecnica CRISPR-Cas9 è possibile correggere una mutazione che provoca una cardiomiopatia ipertrofica senza che si verifichino le due conseguenze più temute tra quelle potenzialmente associate alle tecniche di correzione genetica degli embrioni: il mosaicismo - la condizione in cui la correzione genetica riesce solo in alcune cellule dell'embrione portando a una miscela di cellule sane e malate nei diversi tessuti e organi - e l'insorgenza di nuove mutazioni indesiderate. La cardiomiopatia ipertrofica - una malattia cardiaca ereditaria che colpisce circa una persona su 500 e che può causare morte cardiaca improvvisa e insufficienza cardiaca - è in genere legata a una mutazione a carico del gene per la proteina MYBPC3, che contribuisce al mantenimento strutturale del muscolo cardiaco e alla regolazione della sua contrazione e del rilassamento. La malattia si manifesta sotto forma di insufficienza cardiaca anche se la mutazione riguarda una sola copia dei due geni per questa proteina. I ricercatori avvisano però che quello da loro affrontato era un caso in cui la mutazione era presente in uno solo dei geni. Inoltre, è necessario escludere che l'assenza di mutazioni indesiderate sia legata a una fortunata specificità del gene MYBPC3. CRISPR-Cas9 raggiunge infatti il punto esatto in cui deve operare grazie a un filamento di RNA costruito in modo da legarsi proprio a quel punto. Ma se ci sono regioni del genoma che hanno una grande somiglianza con la sequenza di DNA presa di mira dal filamento-guida di RNA, CRISPR-Cas9 potrebbe agire anche fuori dal suo bersaglio. Il fatto che ciò non si sia verificato nel caso della mutazione di MYBPC3 trattata, non esclude che possa verificarsi per mutazioni diverse o a carico di altri geni.
Sviluppo Embrionale
Embrioni umani geneticamente editati hanno permesso di dare uno sguardo alle prime fasi dello sviluppo, offrendo anche indicazioni sul ruolo di una proteina fondamentale che guida la crescita embrionale. Il primo studio di questo tipo si differenzia dalle ricerche precedenti che hanno cercato di correggere mutazioni che causano malattie negli embrioni umani, nella speranza di prevenire patologie genetiche. Se questi studi hanno sollevato preoccupazioni per la loro potenziale capacità di creare "neonati progettati", quest'ultimo descrive una ricerca di base che mira a comprendere lo sviluppo dell'embrione umano e le cause di aborto spontaneo.Pubblicato on line su "Nature", lo studio si è basato su CRISPR-Cas9, un sistema di editing genomico che può apportare modifiche precise al DNA. Nello specifico, i ricercatori hanno usato CRISPR-Cas9 per interrompere la produzione di una proteina chiamata OCT4, che ha un ruolo importante nello sviluppo degli embrioni. Tradizionalmente i ricercatori hanno effettuato questi studi su embrioni di topi, che sono più abbondanti e sollevano meno problemi etici rispetto agli embrioni umani. Ma l'ultimo studio mette in evidenza differenze fondamentali tra il ruolo di OCT4 negli embrioni umani e in quelli dei topi, sottolineando le limitazioni insite nell'affidarsi ai modelli animali, afferma Dieter Egli ricercatore esperto in cellule staminali alla Columbia University di New York. Per eseguire lo studio, il gruppo guidato da Kathy Niakan, biologa dello sviluppo al Francis Crick Institute di Londra, ha usato un totale di 58 embrioni generati in cliniche di fecondazione assistita in seguito a trattamenti di fecondazione in vitro (FIV). Gli embrioni non erano più necessari per la FIV ed erano stati donati alla ricerca. La UK Human Fertilisation and Embryology Authority ha approvato lo studio: per la prima volta un ente regolatore nazionale ha approvato una ricerca che ha coinvolto l'editing genomico di embrioni umani (studi precedenti effettuati in altri paesi sono stati approvati da qualche comitato di controllo locale). Il gruppo ha iniettato le macchine molecolari necessarie per l'editing genomico con CRISPR-Cas9 quando le uova fecondate, o zigoti, consistevano di una sola cellula, per poi seguirne lo sviluppo in laboratorio per una settimana. Subito è stato chiaro che lo sviluppo normale era deragliato in embrioni che non avevano livelli normali di OCT4. Circa la metà dei controlli (che avevano livelli inalterati e normali OCT4) si sono sviluppati per formare embrioni multicellulari chiamati blastocisti. Degli embrioni modificati con livelli di OCT4 bloccati, solo il 19 per cento si è sviluppato fino a quel punto. Ma saranno necessari ulteriori ricerche su embrioni umani per individuare quello che fa OCT4. Le differenze tra embrioni di topo e umani sono state eclatanti, afferma Amy Ralston, biologa dello sviluppo alla Michigan State University a East Lansing, che ha studiato la proteina nei topi. Il gruppo di Niakan ha infatti scoperto che gli embrioni umani hanno smesso di crescere prima degli embrioni di topi privi della proteina, mostrando anche differenti modelli di espressione genica.
